Análisis molecular de sistemas génicos implicados en la homeostasis de níquel y eficiencia simbiótica en Rhizobium leguminosarum

Los suelos ultramáficos, que poseen elevadas concentraciones de níquel, cobalto y cromo de manera natural, son fuente de bacterias resistentes a altas concentraciones de metales. Se realizó la caracterización físico-química de seis suelos ultramáficos del suroeste europeo, seleccionándose un suelo de la región de Gorro, Italia, como el más adecuado para aislar bacterias endosimbióticas resistentes a metales. A partir de plantas-trampa de guisante y lenteja inoculados con suspensiones de ese suelo, se obtuvieron 58 aislados de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) que fueron clasificados en 13 grupos según análisis de PCR-RAPDs. Se determinó la resistencia a cationes metálicos [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] de una cepa representante de cada grupo, así como la secuencia de los genomas de las cepas que mostraron altos niveles (UPM1137 y UPM1280) y bajos niveles (UPM1131 y UPM1136) de tolerancia a metales. Para identificar mecanismos de resistencia a metales se realizó una mutagénesis al azar en dicha cepa mediante la inserción de un minitransposón. El análisis de 4313 transconjugantes permitió identificar 14 mutantes que mostraron una mayor sensibilidad a Ni(II) que la cepa silvestre. Se determinó el punto de inserción del minitransposón en todos ellos y se analizaron en más detalle dos de los mutantes (D2250 y D4239). En uno de los mutantes (D2250), el gen afectado codifica para una proteína que presenta un 44% de identidad con dmeF (divalent efflux protein) de Cupriavidus metallidurans. Cadena arriba de dmeF se identificó un gen que codifica una proteína con un 39% de identidad con el regulador RcnR de Escherichia coli. Se decidió nombrar a este sistema dmeRF, y se generó un mutante en ambos genes en la cepa Rlv SPF25 (Rlv D15). A partir de experimentos de análisis fenotípico y de regulación se pudo demostrar que el sistema dmeRF tiene un papel relevante en la resistencia a Ni(II) y sobre todo a Co(II) en células en vida libre y en simbiosis con plantas de guisante. Ambos genes forman un operón cuya expresión se induce en respuesta a la presencia de Ni(II) y Co(II). Este sistema se encuentra conservado en distintas especies del género Rhizobium como un mecanismo general de resistencia a níquel y cobalto. Otro de los mutantes identificados (D4239), tiene interrumpido un gen que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC. Aunque inicialmente fue identificado por su sensibilidad a níquel, experimentos posteriores demostraron que su elevada sensibilidad a metales era debida a su sensibilidad al medio TY, y más concretamente a la triptona presente en el medio. En otros medios de cultivo el mutante no está afectado específicamente en su tolerancia a metales. Este mutante presenta un fenotipo simbiótico inusual, siendo inefectivo en guisantes y efectivo en lentejas. Análisis de complementación y de mutagénesis dirigida sugieren que el fenotipo de la mutación podría depender de otros factores distintos del gen portador de la inserción del minitransposón. ABSTRACT Ultramafic soils, having naturally high concentrations of nickel, cobalt and chrome, are potential sources of highly metal-resistant bacteria. A physico-chemical characterization of six ultramafic soils from the European southwest was made. A soil from Gorro, Italy, was chosen as the most appropriated for the isolation of heavy-metal-resistant endosymbiotic bacteria. From pea and lentil trap plants inoculated with soil suspensions, 58 isolates of Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) were obtained and classified into 13 groups based on PCR-RAPDs analysis. The resistance to metallic cations [Ni(II), Co(II), Cu(II), Zn(II)] was analyzed in a representative strain of each group. From the results obtained in the resistance assays, the Rlv UPM1137 strain was selected to identify metal resistance mechanism. A random mutagenesis was made in UPM1137 by using minitransposon insertion. Analysis of 4313 transconjugants allowed to identify 14 mutants with higher sensitivity to Ni(II) than the wild type strain. The insertion point of the minitransposon was determined in all of them, and two mutants (D2250 and D4239) were studied in more detail. In one of the mutants (D2250), the affected gene encodes a protein with 44% identity in compared with DmeF (divalent efflux protein) from Cupriavidus metallidurans. Upstream R. leguminosarum dmeF, a gene encoding a protein with 39% identity with RcnR regulator from E. coli was identified. This protein was named DmeR. A mutant with both genes in the dmeRF deleted was generated and characterized in Rlv SPF25 (Rlv D15). From phenotypic and regulation analysis it was concluded that the dmeRF system is relevant for Ni(II) and specially Co(II) tolerance in both free living and symbiotic forms of the bacteria. This system is conserved in different Rhizobium species like a general mechanism for nickel and cobalt resistance. Other of the identified mutants (D4239) contains the transposon insert on a gene that encodes for an AraC-like transcriptional regulator. Although initially this mutant was identified for its nickel sensitivity, futher experiments demonstrated that its high metal sensitivity is due to its sensitivity to the TY medium, specifically for the tryptone. In other media the mutant is not affected specifically in their tolerance to metals. This mutant showed an unusual symbiotic phenotype, being ineffective in pea and effective in lentil. Complementation analysis and directed mutagenesis suggest that the mutation phenotype could depend of other factors different from the insertion minitransposon gene.

Contribución metodológica para incorporar fallas activas en la modelización de la fuente dirigida a estimaciones de peligrosidad sísmica. Aplicación al sur de España

En el presente trabajo se desarrolla una metodología para caracterizar fallas activas como fuentes sísmicas independientes en combinación con zonas sismogenéticas tipo área de cara a la estimación probabilista poissoniana de la peligrosidad sísmica. Esta metodología está basada en el reparto de la tasa de momento sísmico registrada en una región entre las fuentes potencialmente activas subyacentes (fallas activas modelizadas de forma independiente y una zonificación sismogenética), haciendo especial hincapié en regiones de sismicidad moderada y fallas de lento movimiento. Se desarrolla una aplicación de la metodología en el sureste de España, incorporando al cálculo 106 fuentes sísmicas independientes: 95 de tipo falla (catalogadas como fallas activas en la base de datos QAFI) y 11 zonas sismogenéticas de tipo área. Del mismo modo, se estima la peligrosidad sísmica con el método clásico zonificado y se comparan los resultados, analizando la influencia de la inclusión de las fallas de forma independiente en la estimación de la peligrosidad. Por último, se desarrolla una aplicación de la metodología propuesta en la estimación de la peligrosidad sísmica considerando un modelo temporal no poissoniano. La aplicación se centra en la falla de Carboneras, mostrando la repercusión que puede tener este cambio de modelo temporal en la estimación final de la peligrosidad. ABSTRACT A new methodology of seismic source characterization to be included in poissonian, probabilistic seismic hazard assessments, is developed in this work. Active faults are considered as independent seismogenic sources in combination with seismogenic area sources. This methodology is based in the distribution of the seismic moment rate recorded in a region between the potentially active underlying seismic sources that it contains (active faults modeled independently and an area-source seismic model), with special emphasis on regions with moderate seismicity and faults with slow deformation rates. An application of the methodology is carried out in the southeastern part of Spain, incorporating 106 independent seismic sources in the computations: 95 of fault type (catalogued as active faults in the Quaternary Active Fault Database, QAFI) and 11 of area-source type. At the same time, the seismic hazard is estimated following the classical area-source method. The results obtained using both methodologies (the classical one and the one proposed in this work9 are compared, analyzing the influence of the inclusion of faults as independent sources in hazard estimates. Finally, an application of the proposed methodology considering a non-poissonian time model is shown. This application is carried out in the Carboneras fault and shows the repercussion that this change of time model has in the final hazard estimates.

Simulación de evolución dirigida de bacteriófagos en poblaciones de bacterias en 2D

The research group is currently developing a biological computing model to be implemented with Escherichia Coli bacteria and bacteriophages M13, but it has to be modelled and simulated before any experiment in order to reduce the amount of failed attempts, time and costs. The problem that gave rise to this project is that there are no software tools which are able to simulate the biological process underlying that com- putational model, so it needs to be developed before doing any experimental implementation. There are several software tools which can simulate most of the biological processes and bacterial interactions in which this model is based, so what needs to be done is to study those available simulation tools, compare them and choose the most appropriate in order to be improved adding the desired functionality for this design. Directed evolution is a method used in biotechnology to obtain proteins or nucleic acids with properties not found in nature. It consists of three steps: 1) creating a library of mutants, 2) selecting the mutants with the desired properties, 3) replicating the variants identified in the selection step. The new software tool will be verified by simulating the selection step of a process of directed evolution applied to bacteriophages. ---ABSRACT---El grupo de investigación está desarrollando un modelo de computación biolóogica para ser implementado con bacterias Escherichia Coli y bacteriofagos M13, aunque primero tiene que ser modelizado antes de realizar cualquier experimento, de forma que los intentos fallidos y por lo tanto los costes se verán reducidos. El problema que dio lugar a este proyecto es la ausencia de herramientas software capaces de simular el proceso biológico que subyace a este modelo de computación biológica, por lo que dicha herramienta tiene que ser desarrollada antes de realizar cualquier implementación real. Existen varias herramientas software capaces de simular la mayoría de los procesos biológicos y las interacciones entre bacterias en los que se basa este modelo, por lo que este trabajo consiste en realizar un estudio de dichas herramientas de simulación, compararlas y escoger aquella más apropiada para ser mejorada añadiendo la funcionalidad deseada para este diseño. La evolución dirigida es un método utilizado en biotecnología para obtener proteínas o ácidos nucleicos con propiedades que no se encuentran en la naturaleza. Este método consiste en tres pasos: 1) crear una librería de mutantes, 2) seleccionar los mutantes con las propiedades deseadas, 3) Replicar los mutantes deseados. La nueva herramienta software será verificada mediante la simulación de la selección de mutantes de un proceso de evolución dirigida aplicado a bacteriofagos.

Termoquímica de las calderas domésticas de condensación: un caso de aprendizaje contextualizado por indagación dirigida

Se proponen cuestiones para que los alumnos indaguen sobre aspectos relacionados con las calderas de conden· sación, que producen agua líquida en vez de vapor. Los objetivos son los siguientes: favorecer el aprendizaje de conceptos (termoquímica, combustión, gas natural, etc.); promover la motivación de alumnos y profesores; fomentar enfoques ciencia?tecnología?sociedad, y colaborar en la formación de competencias (indagación, reso· lución de problemas, análisis de datos, trabajo en equipo, etc.). Se promueve el pensamiento crítico y la forma· ción en «química del consumidor», tratando aspectos como los motivos de la ayuda pública para la instalación de estas calderas y el empleo de la factura del gas como fuente de información